此后第二年，Henderson、Agard和其他冷凍電鏡的狂熱支持者有條不紊地實(shí)現(xiàn)了各種技術(shù)改善，尤其是找到了感知電子的更好方法。在數(shù)碼相機(jī)風(fēng)靡世界很久之后，很多電子顯微鏡專家仍然偏好過(guò)時(shí)的膠片，因?yàn)樗鼙葦?shù)字傳感器更高效地記錄電子。不過(guò)，和顯微鏡生產(chǎn)廠商一道，研究人員開(kāi)發(fā)出遠(yuǎn)超膠片和數(shù)碼相機(jī)探測(cè)器的新一代直接電子探測(cè)器。
這些從2012年左右獲得應(yīng)用的探測(cè)器，能以每秒幾十幀的速率捕捉單一分子的速射圖像。與此同時(shí)，諸如Scheres等研究人員編寫(xiě)了復(fù)雜的軟件程序，將上千幅2D圖像轉(zhuǎn)變成在很多情況下可與晶體學(xué)解析的分子圖像質(zhì)量相媲美的3D模型。
冷凍電鏡適合能忍受電子轟擊而不會(huì)四處晃動(dòng)的穩(wěn)定、大型分子，因此通常由幾十個(gè)蛋白制成的分子機(jī)器是很好的目標(biāo)。而研究證明，沒(méi)有什么比由RNA相互纏繞支撐的核糖體更加合適了。通過(guò)X射線晶體學(xué)解析核糖體結(jié)構(gòu)的方法，讓3位化學(xué)家獲得了2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。過(guò)去幾年里，不同的研究團(tuán)隊(duì)迅速發(fā)表了來(lái)自眾多生物體的核糖體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，包括首個(gè)人類核糖體高分辨率模型。在由分享了2009年諾貝爾獎(jiǎng)的Venki Rama krishnan領(lǐng)導(dǎo)的LMB實(shí)驗(yàn)室，X射線晶體學(xué)在很大程度上變得無(wú)人問(wèn)津。他認(rèn)為，對(duì)于大型分子來(lái)說(shuō)，“冷凍電鏡將大幅取代晶體學(xué)技術(shù)的預(yù)測(cè)是可靠的”。
今年5月，加拿大多倫多大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家John Rubinstein和他的同事利用約10萬(wàn)幅冷凍電鏡圖像，創(chuàng)建了一種名為V-ATPase、形狀類似轉(zhuǎn)子的酶的“分子影片”。V-ATPase通過(guò)燃燒三磷酸腺苷（ATP）推動(dòng)質(zhì)子進(jìn)出細(xì)胞液泡?！拔覀兛吹降氖且磺惺虑槎荚陟`活進(jìn)行?！盧ubinstein說(shuō)，“它在彎曲、扭動(dòng)和變形?！痹谒磥?lái)，這種酶的靈活性能幫助其高效傳遞ATP釋放的能量。
統(tǒng)治結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域
像任何新興領(lǐng)域一樣，冷凍電鏡領(lǐng)域也有著成長(zhǎng)的煩惱。一些專家擔(dān)心，競(jìng)相利用此項(xiàng)技術(shù)的研究人員會(huì)產(chǎn)生有問(wèn)題的結(jié)果。2013年發(fā)表的一種艾滋病病毒表面蛋白的結(jié)構(gòu)，便受到科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認(rèn)為，用于構(gòu)建模型的圖像是白噪聲。從那以后，雖然其他團(tuán)隊(duì)產(chǎn)生的X射線和冷凍電鏡模型對(duì)原始模型提出了挑戰(zhàn)，但這些研究人員一直堅(jiān)守他們的成果。
今年6月，在高登會(huì)議上，想要更多質(zhì)量控制的研究人員通過(guò)一項(xiàng)決議，督促各期刊為審稿人提供關(guān)于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)如何被創(chuàng)建的細(xì)節(jié)資料。
成本也會(huì)減緩此項(xiàng)技術(shù)的擴(kuò)散。據(jù)Scheres估算，LMB每天花費(fèi)約3000英鎊運(yùn)行其冷凍電鏡設(shè)備，還要加上1000英鎊的電費(fèi)。大部分電費(fèi)是由儲(chǔ)存和處理圖像所需的計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的?！皩?duì)于很多實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，這是一項(xiàng)很高的開(kāi)支?！?/span>
為了讓冷凍電鏡的使用更加便利，一些資助者建立了研究人員能預(yù)定時(shí)間的共享設(shè)備?；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究所（HHMI）在其弗吉尼亞州珍利亞農(nóng)場(chǎng)校區(qū)運(yùn)營(yíng)著一個(gè)對(duì)HHMI資助的研究人員開(kāi)放的冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)室。在英國(guó)，由政府和惠康基金會(huì)資助的一臺(tái)全國(guó)性冷凍電鏡設(shè)備，今年在牛津附近的迪德科特開(kāi)始運(yùn)行?！叭藗兿胍私饫鋬鲭婄R，已成為當(dāng)下的一股浪潮。”幫助建立上述設(shè)備的倫敦大學(xué)伯克貝克學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)家HelenSaibil表示。
追趕這一浪潮的還有紐約洛克菲勒大學(xué)生物物理學(xué)家RodMacKinnon。他因確定了特定離子通道的晶體結(jié)構(gòu)而共同分享了2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，但如今卻在深入研究冷凍電鏡?！拔艺幵趯W(xué)習(xí)曲線的陡坡上，而這總是令我興奮不已?！盡acKinnon希望利用冷凍電鏡研究離子通道是如何打開(kāi)和關(guān)閉的。
當(dāng)Henderson在1997年反駁說(shuō)冷凍電鏡將統(tǒng)治結(jié)構(gòu)生物學(xué)世界時(shí)，他或許是在口是心非。但將近20年以后，他的預(yù)言已不像當(dāng)時(shí)看上去的那么夸張?！叭绻^續(xù)發(fā)展下去，并且所有技術(shù)問(wèn)題都得到解決，冷凍電鏡確實(shí)會(huì)成為一種占據(jù)統(tǒng)治地位的技術(shù)，而不僅僅是第一選擇?！盚enderson說(shuō)，“我們或許已經(jīng)成功了一半?！?/span>
